基因治療修復骨缺損的研究進展
摘要： 目的：創傷、炎癥、腫瘤及人工關節翻修手術等導致的骨缺損是目前骨科臨床的常見病和難治病。傳統的治療方法是通過骨移植進行修復，包括自體骨、異體骨、異種骨和人工骨材料。自體骨移植的取骨手術增加患者創傷，取骨量有限，常不能滿足植骨需求；異體骨和異種骨均存在排異，前者存在交叉感染問題，后者排異反應尤為劇烈，經脫鈣、煅燒等處理后有益的活性物質又會破壞殆盡，限制了臨床使用。骨缺損的基因治療克服了傳統治療方法的局限，具有重要研究意義。 資料與方法：①檢索數據庫： Medline數據庫和中國知網數據庫。檢索時間范圍：1989-01/2009-12。英文關鍵詞“bone gene therapy”，中文關鍵詞“骨缺損 基因治療 骨形成蛋白 組織工程”。②資料選擇：對資料進行初審，選取符合研究要求的有關文章，并開始查找全文。納入標準：有關骨缺損的基因治療研究；有關骨組織工程研究。排除標準：重復研究；綜述文章。③資料提煉：共收集到128篇有關骨缺損的基因治療及組織工程骨方面的文章，排除重復或類似的同一研究，31篇符合研究要求。④資料綜合：基因治療骨缺損的技術選擇：人骨形態發生蛋白基因是目前骨缺損基因治療中應用最多的目的基因，已在兔、鼠、羊和狗模型中證實其對骨缺損的修復作用。各種研究中，靶細胞多采用骨髓基質細胞，載體多選用腺病毒。基因治療骨缺損研究進展：基因治療與組織工程相結合以及多基因聯合治療骨缺損是該領域研究的方向。問題與展望：目前的研究大多處于實驗階段，要應用于臨床還有很多問題需要研究解決。 結論：多種細胞生長因子具有促進骨愈合的作用，通過骨缺損的基因治療方法可保證細胞生長因子局部的靶向釋放，最大限度地增加局部治療效果，減少全身副作用，被認為是維持骨缺損局部生長因子有效治療濃度最有希望的一種方法。
關鍵詞： 基因/治療；骨缺損/創傷；修復外科手術；綜述文獻
引言 基因治療是骨缺損修復研究的熱點之一。自1965年Urist首先發現脫鈣骨基質具有骨誘導能力以來，人們陸續發現多種細胞生長因子具有促進骨愈合的作用。隨著細胞重組技術的發展，越來越多參與骨修復的生長因子的基因被成功克隆，使得基因治療骨缺損成為一種可能。但重組細胞生長因子在體內半衰期短、容易被體液沖走或稀釋，為保持局部有效治療濃度，往往需要大劑量、反復注射，由此可能增加患者系統毒性和治療費用。
骨缺損的局部基因治療是將具有成骨作用的基因轉入靶細胞，由靶細胞轉錄成mRNA并翻譯成蛋白質。依靠蛋白質的作用，靶細胞被刺激分化，通過自分泌或旁分泌的方式促進成骨。當前對基因治療修復骨缺損的研究主要在骨誘導因子、目的基因、各種載體及靶細胞等方面,將目的基因通過體內或體外途徑轉移靶細胞,維持骨誘導因子在局部持續有效地表達,從而治療修復骨缺損。基因治療具有的優點是:①基因產物可以局部和靶向釋放；②可最大限度地增加局部治療效果,減少全身副作用；③多種基因可分別轉向,并分別調控,內源性合成的蛋白質比外源性重組蛋白質具有更強的生物活性等優點。因此基因治療被認為是維持骨缺損局部生長因子有效治療濃度最具有希望的一種方法[1,2,]。現就基因治療骨缺損的研究進展綜述如下。
1 基因治療發展概況
基因治療是現代分子生物學技術發展的產物。基因治療的概念是在20世紀80年代初期提出的,隨后獲得了飛快的發展。20世紀90年代初期,隨著世界首例腺苷脫氧酶(ADA)缺乏性重癥免疫缺陷病的治療獲得成功[2],基因治療獲得了臨床治療的批準,進而推動了其他一些疾病的基因治療的發展。早期的基因治療是向靶細胞引入外源性基因,以補償其基因缺陷,從而達到治療目的。隨著基因治療技術的發展,基因治療已不再局限于治療遺傳性基因缺陷性疾病,而是將外源基因導入目的細胞并有效表達,從而達到治療目的。創傷、炎癥、腫瘤及人工關節翻修手術等各種因素均可造成骨缺損,其治療修復一直是臨床難題。骨缺損的傳統治療包括自體骨移植、異體骨和人工骨移植,每種方法均存在一定的局限性,難以完全滿足臨床需要。人們用移植物修復骨缺損和促進骨愈合時,希望移植物既有成骨傳導(osteoconduction)作用,又有成骨誘導(osteoinduction)作用。在基因治療中后者越來越顯得重要。現已證明生長因子如BMP、TGF-P、PDGF等有促進骨修復的作用,只要在骨缺損的部位集聚合適的生長因子,就可以產生足夠的成骨誘導應答。但是生長因子的表達往往是短暫的,只有通過轉基因技術,用目的基因轉染靶細胞,使之穩定長效地分泌生長因子,才可望達到預期的良好療效。近年來,國內外已經開始使用基因治療一些骨科疾病,并取得了一些階段性成果,基因治療修復骨缺損是目前進展最快的領域之一[3～26]。
2 基因治療修復骨缺損的技術選擇
基因治療骨缺損的方法很多，需要根據研究目的不同，可選擇不同的目的基因、不同的靶細胞、不同的基因載體以及不同的基因轉移方法等。
2.1 目的基因的選擇 基因治療修復骨缺損需要選擇目的基因、靶細胞和基因載體,然后通過基因轉移技術來實施修復治療的目的。基因治療首要的問題是選擇用于治療的目的基因。凡是能促進骨折愈合和骨生長的基因理論上均可作為基因治療骨缺損的目的基因。主要包括骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、可溶性生長因子[如血小板衍生生長因子(PDCF)、成纖維細胞生長因子(FCF)、胰島素樣生長因子(ICF)］、影響合成代謝的因子[如甲狀旁腺激素(PTH)，甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)］、影響血管生成因子[如血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FCF)]、影響骨相關基因表達的因子(Rune2/Cbfal、Osterix、Sox9、DLX2-6)、細胞外基質中的受體及受體拮抗因子（如白細胞介素1受體、骨形態發生蛋白受體）及礦化蛋白-1(LM-1)等。這些基因表達的產物多為細胞外分泌型因子，但也有例外，如礦化蛋白-1就屬于細胞內因子。BMP是骨生長修復的啟動因子,它能誘導骨髓基質細胞分化為成骨細胞和骨細胞,促進鈣化作用,產生鈣化的骨基質完成修復過程。隨著重組DNA技術的應用,已有十多種BMPcDAN被成功克隆。BMP是目前骨缺損基因治療修復中應用研究最多的目的基因,已在兔、鼠、羊和犬模型中證實其對骨缺損的修復作用。有研究證明[4～7]BMP-2和BMP-7是BMP家族成員中作用最強的因子。
2.2 目的基因載體選擇 基因治療需要合適的載體,載體的作用在于避免載體的宿主細胞對外源性基因產物的排斥反應。理想的載體應滿足以下條件:①有對特定靶細胞的選擇性；②能傳導分裂和非分裂的細胞；③有效地將目的基因整合入宿主細胞的DNA；④在調控好的治療水平內提供短期或長期的基因表達；⑤高滴度制造目的基因；⑥成本合理適宜于應用治療。基因表達載體有病毒表達載體和非病毒表達載體。目前這兩種載體基本具備上述大部分條件。病毒表達載體種類很多,有RNA逆轉錄病毒、DNA腺病毒和DNA腺相關病毒(AAV)等；非病毒基因表達載體有脂質體、DNA質粒、DNA配體復合物、裸DNA和基因槍等。目前被研究應用最多的是腺病毒載體,已有多種腺病毒載體被用作研究基因的傳遞工具,包括重組腺病毒載體在內[9～11]。病毒載體能高滴度地生產目的基因,很容易轉染分裂期和非分裂期細胞[12]；但其缺點在于病毒殼體蛋白在靶細胞表面,容易吸引免疫活性細胞如細胞毒性疾病引起免疫反應而成為在基因治療非致死性疾病方面的最大障礙。Okuboy等[13]在將Ad-BMP-2注射到兔腓腸肌內的術前1天使用環磷酰胺(125mg/kg)來抑制腺病毒殼體質蛋白的急性免疫反應,結果經短暫的免疫抑制后,Ad-BMP-2仍具有異位誘導成骨作用。非病毒載體雖然比病毒載體容易生產,操作簡易安全,化學穩定性強,不會引起強烈的免疫應答,而且可以重復使用,但它們在體內轉染的效能低,使其在研究應用上受到很大的制約。在基因治療中,要根據體內或體外轉導方式、蛋白功能預計持續時間,解剖部位和治療條件來選擇合適的載體。Kang等[3]和Hannallah等[14]分別就兩種載體在骨科基因治療領域的應用作過總結報道。
2.3 靶細胞的選擇 靶細胞選擇是關系到基因治療是否成功的一個重要因素。理論上，任何細胞均具有接受外源基因的能力，但因為倫理及法律等因素，目前基因治療中禁止使用生殖細胞作為靶細胞。用于基因治療的靶細胞應具有取材容易，含量豐富，在體外容易培養，外源基因能夠高效導入并表達，細胞壽命長等一些條件。骨缺損修復部位的所有細胞理論上均可選為基因治療的靶細胞,但選擇時須考慮具體的解剖部位、骨骼和周圍軟組織的質量。對于誘導成骨的基因治療,體外轉導方式和技術實際上已決定了靶細胞。骨缺損基因治療中應用的靶細胞主要有骨髓基質干細胞(bone marrow stemcells, BMSC)、骨骼肌細胞、成纖維細胞等。骨髓基質干細胞具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞的潛能,它從體內收集后可以在細胞培養中擴增,再分離出來后用作誘導成骨和促進骨修復的基因治療的靶細胞,其效果在動物實驗研究已有證明[15～17]。BMSC不僅作用誘人,而且數量龐大,因為細胞培養時它能擴增近300倍,而且即使擴增超過10億倍,仍未丟失它本身的潛能。BMSC不能分泌或旁分泌蛋白如BMP,而且能對這些蛋白產生應答,這種自分泌和旁分泌的應答更加能促進骨修復。Musgrave等[18]比較了骨髓基質干細胞、初級骨基質細胞、初級肌母細胞、初級軟骨細胞和初級成纖維細胞等5種不同類型的細胞轉導BMP-2基因后分泌該蛋白的能力,結果發現了這5種細胞能在體外成功分泌BMP-2,并在體內誘導異位成骨,其中骨BMSC能力最強,初級肌母細胞次之；同時檢測了5種細胞內堿性磷酸酶(ACP)的活性,并以此來評價5種細胞對BMP-2的反應靈敏度,結果與上相同。因此,BMSC具有來源廣泛,在體外培養體系中擴增迅速,并能長期穩定地表達多種載體介導的外源性目的基因等優勢。所以BMSC作為一種基因治療的靶細胞有許多優勢,被研究應用最多,已經顯示出廣闊的前景[19～23]。
2.4 基因轉移的方法 將外源性基因插入宿主或供體細胞,使它們具有分泌生長因子的細胞微泵功能,這就是基因轉移技術。基因轉移的方法有兩種: 體內轉移技術(in vivo)和體外轉移技術(ex vivo)。
體內基因轉移是通過直接將含有目的基因的病毒表達載體或質粒注射到骨缺損局部。該技術簡單易行,在手術室就可以操作,具有顯著的應用優勢。Musgrave[24]用體內轉移技術將BMP-2腺病毒載體直接注射到裸鼠和正常鼠大腿肌肉,觀察異位誘導成骨作用,結果術后2周均可見異位骨形成,X線和組織學觀察見成熟的骨髓組織,但裸鼠異位成骨的數量明顯多于正常鼠。Baltzer等[10]采用直接注射攜帶BMP-2基因的腺病毒的方法修復兔股骨干1.3cm骨缺損,通過放射學、組織學和生物力學等分析證實骨缺損得以修復；對照組骨缺損處大部分為纖維化,骨化稀疏不穩定。體外轉移技術是從組織中分離靶細胞,進行體外培養,將目的基因進行轉染后重新植入局部。因為體外轉基因沒有將病毒顆粒或DNA復合物直接注射到體內,所以可以選擇靶細胞,而且在技術上具有高效率的細胞轉導。因此用腺病毒載體進行體外轉基因比體內轉基因安全,同時體外細胞的獲取、感染、轉導和植入合適的解剖部位所需的時間較短,操作簡單,可根據實際需要復合人工骨材料后植入。但其缺點是方法復雜,需要收集靶細胞,費時且費用較高。徐小良等[25]用腺病毒介導的BMP-2基因轉染兔骨髓充質干細胞修復兔橈骨缺損,BMP-2能在局部持續表達2～3周,并誘導本身和周圍骨髓干細胞向成骨細胞分化成骨。金丹等報道[26]hBMP-7基因轉染修復兔橈骨中段1.5cm骨缺損的研究證實了逆轉錄病毒的hBMP-7基因轉染能提高BMSC構建組織工程化骨組織和修復骨缺損能力,經轉染的BMSC不僅充當了骨組織工程的種子細胞,并且能夠作為外源hBMP-7的釋放載體進一步提高成骨效果。另外有學者[27,28]用明膠海綿作為質粒水泵載體將外源性生長因子較長時間停留在創傷部位,從而延長其基因表達時間,加快骨缺損修復速度。
3 多基因聯合治療修復骨缺損
目前對骨缺損的基因治療研究多集中在單個目的基因應用方面,實際上,在骨愈合和骨生成過程中,有多個基因共同參與,并協同表達。近年來許多實驗證明,多個基因的聯合傳遞更能促進骨修復,如Musgrave等[29]和Franceschi等[30]將分別攜帶BMP-2、4和7的腺病毒載體并轉染細胞,測定細胞培養上清液中ALP的活性,結果發現,Ad-BMP-7聯合時,細胞上清液中ALP的活性均較單基因應用時提高2～4倍,提示聯合應用時成骨能力提高,但Ad-BMP-2與Ad-BMP-4聯合時,與Ad-BMP-2單獨應用無差異。隨著基因治療技術的不斷發展,新型基因載體的不斷應用,今后會有越來越多的基因如BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9、VEGF等聯合轉入相應的種子細胞,使基因治療修復骨缺損的成骨能力進一步明顯提高,同時也能為一些復雜的骨組織疾病或骨腫瘤的治療提供新思路和新方法。
4 基因治療與組織工程結合修復骨缺損
利用基因工程技術與組織工程技術相結合的辦法，將基因治療中攜帶目的基因的靶細胞作為組織工程骨的種子細胞，與支架材料復合構建而成的人工骨稱為基因強化組織工程骨。骨修復是一個復雜的生物學過程,局部基因治療能促進骨誘導,為臨床加快骨愈合,治療骨缺損提供更可行、有效、廉價而并發癥少的新方法。目前的研究,一方面應用體內轉移技術將含有目的基因的病毒載體或質粒注射到骨缺損局部進行治療修復,另一方面應用體外轉移技術從組織中分離靶細胞,與支架材料復合構建而成人工骨,即基因強化組織工程骨,再移植治療修復骨缺損,這樣既保持了移植物的成骨傳導作用,又提供了基因治療中的成骨誘導作用,從而保證了骨生長修復的效果。金丹等[25]用hBMP-7基因轉染兔骨質細胞后,與左旋聚丙交酯(PLLA)復合培養,組建基因強化的組織工程骨修復兔橈骨中段1.5cm缺損。術后3周時,hBMP-7轉染骨髓基質干細胞,BMSC+PLLA組和未轉染BMSC+PLLA組骨缺損兩端和缺損中心有密度增高影,提示有新骨生成，6周時新骨量增多,但轉染組形成的新骨與正常兔橈骨相似,而未轉染組形成的骨橋較薄,體積明顯小于前者；單獨PLLA組和對照組缺損兩端只有少量骨組織形成,大部分被纖維結締組織充滿,骨缺損未修復。利用基因強化組織工程骨技術治療骨缺損既保留了基因治療和組織工程骨單獨治療骨缺損時的優點，又克服了單獨使用時的不足，是未來研究治療復雜性骨缺損的方向。
5 問題與展望
創傷、炎癥、腫瘤及人工關節翻修手術等均可造成骨缺損。傳統的治療方法包括自體骨移植、異體骨移植和人工骨等，這些方法均有一定的局限性，難以完全滿足臨床需要。目前,基因治療修復骨缺損的基礎研究已取得了重大的進展,已成為基因治療最有前途的領域之一,很快將進入臨床研究階段[31]。但目前的研究大多處于實驗階段，要應用于臨床還有很多問題需要解決,如技術、費用、療效、安全及倫理等。在今后的研究中,如何解決病毒載體的免疫反應,保證宿主不感染,如何增加非病毒載體的表達效率,選擇何種受體細胞表達目的基因的效果最好,基因強化組織工程骨中開發應用等等問題,仍是研究的重點和難點。隨著對骨形成、修復和重建的生物學研究的深化,對基因轉移的工具、技術及其治療策略的優化以及基因強化組織工程骨的開發應用,基因技術治療骨缺損的應用前景將更加廣闊。
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